Dulliau Ar Gyfer Adnabod Ffosfforyleiddiad Protein A Glycosylation

Aug 02, 2024 Gadewch neges

Mae'r prif ddulliau ar gyfer adnabod ffosfforyleiddiad fel a ganlyn: a. Dadansoddiad ffosfforyleiddiad in vitro: Gellir defnyddio adweithiau kinase radiometrig gan ddefnyddio 32P-gamma-ATP i ganfod statws ffosfforyleiddiad in vitro; mae'r dull hwn yn lled-meintiol, ond gall bennu pwysau moleciwlaidd proteinau ffosfforyleiddiad. b. Labelu pwls ymbelydrol: Er mwyn canfod ffosfforyleiddiad mewn vivo, gellir defnyddio labelu pwls ymbelydrol; mae celloedd yn cael eu tyfu ym mhresenoldeb 32P-orthoffosffad, ac yna mae protein penodol yn cael ei imiwneiddio â gwrthgorff penodol. Mae'r radioisotop a geir trwy wlybaniaeth yn cael ei ddadansoddi gan electrofforesis SDS-PAGE a'i fesur yn ôl datguddiad ffilm pelydr-X. Gall y dull hwn ganfod ffosfforyleiddiad o dan amodau ffisiolegol amrywiol. c. Gwrthgyrff sy'n benodol i ffosfforyleiddiad: Mae dau gategori o wrthgyrff sy'n benodol i ffosfforyleiddiad. Y categori cyntaf yw gwrthgorff tyrosine ffosfforyleiddiad cyffredinol / serine / threonine a fydd yn rhwymo i unrhyw tyrosine ffosfforylated, serine ffosfforylated, a moleciwl threonine ffosfforylated, waeth beth fo'r gweddillion asid amino cyfagos; yr ail gategori o wrthgyrff yw gwrthgorff epitope asid amino sy'n benodol i ffosfforyleiddiad. Wrth gwrs, gellir cyfuno'r dulliau uchod â modd caffael data neu ar ôl sbectrometreg màs i nodi safleoedd ffosfforyleiddiad (dybiedig), defnyddio gwrthgyrff cyffredinol ar gyfer safleoedd ffosfforyleiddiad i benderfynu a yw'r protein targed wedi'i ffosfforyleiddio ar fath penodol o safle trwy imiwnodiad (IP). .

 

Gellir cyflawni dadansoddiad glycosyleiddiad trwy dreulio ensymatig (fel treuliad trypsin) o'r protein i'w ddadansoddi, ac yna dadansoddiad o glycopeptidau gan ddefnyddio cromatograffaeth hylifol-sbectrometreg màs (LC-MS) neu sbectrometreg màs cromatograffaeth-tandem rhyngweithio hydroffilig (HILIC-MS/). MS) i nodi'r holl broteinau sydd â moleciwlau glycan penodol, neu'r safleoedd rhwymo glycan yn y protein targed. Yn ogystal, ar gyfer rhai glycopeptidau, gall dadansoddiad sbectrometreg màs (MS) o broteinau cyfan ddarparu data ar adnabod rhywogaethau protein a'u statws glycosyleiddiad, ond ar gydraniad is.

 

I grynhoi, er bod y dulliau ar gyfer adnabod ffosfforyleiddiad protein a glycosylation yn wahanol, gellir dadansoddi'r ddau gan ddefnyddio sbectrometreg màs, gan gynnwys adnabod proteinau ffosfforyleiddiad/glycosylated, safleoedd addasu ffosfforyleiddiad/glycosylation, a lefelau addasu. Mae sbectrometreg màs hefyd wedi dod yn un o'r technolegau ymchwil addasu ôl-gyfieithu mwyaf poblogaidd oherwydd ei gydraniad, cywirdeb a sensitifrwydd uwch.

Anfon ymchwiliad

whatsapp

Dros y ffôn

E-bost

Ymchwiliad